울산의대 서울아산병원
차세대염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)를 이용한 면역글로불린(immunoglobulin, IG) 또는 T-세포 수용체 (T-cell receptor, TCR) 유전자의 클론성 재배열 검출은 급성림프모구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL)의 미세잔 존질환(minimal residual disease, MRD)의 검출 및 정량에 매우 예민하고 특이도가 높은 검사법이다.
이 검사는 최근 국내 임상검사실에서도 시행되고 있는데, EuroClonality-NGS에서 ALL의 IG, TCR 유전자 재배열 MRD검 사의 시행에 대한 표준화된 검사법을 제시하였지만, 결과의 해석과 보고에 관한 가이드라인은 아직 제시되지 않았다. 본 권고 안은 해당 검사의 결과 해석 및 보고에 대한 방향을 제시하고자 작성되었다. 이 권고안은 크게 index sequence 선정 검사에 대한 부분과 MRD 측정 검사에 대한 부분으로 나뉜다.
1. 유전자 재배열 검사에서 index sequence 선정 검사의 결과 해석 및 보고 Index sequence는 백혈병 클론의 특징적인 유전자 재배 열로 MRD 측정의 대상이 된다. ALL의 lineage에 따라 적절한 primer set를 적절한 순서로 적용하여 백혈병 클론에 대한 대표성이 있는 index sequence를 선정하며, 다음과 같은 사항을 고려하여야 한다.
(1) Index sequence 선정 기준 설정
최소 total read와 total read 중의 %, sequencing error를 고려한 mismatch의 정도, 유전자의 조합을 고려하여 index sequence 선정에 대한 기준을 마련한다. 치료 중 또는 재발시에 clonal escape가 있을 수 있어 가능하다면 여러 개의 유전자의 index sequence를 추적 관찰하는 것이 안전하나, 이는 비용효과성을 고려해야 한다. 또한 선정 기준에 완전히 부합하지 않더라도, 백혈병 클론과 관련이 있을 가능성이 있는 sequence를 (suspected) index sequence로 선정할 것인지 결정하여야 한다. 한 유전자에서 index sequence가 2개 이상 발견되는 MRD 모니터링 시 두 index sequence의 양을 합산할지 여부도 정해야 하는데, 아직 이에 대한 학술적인 근거는 확립되어 있지 않다.
다클론 재배열 중 특정 sequence가 상대적인 비율이 높아 백혈병 클론의 클론성 재배열로 오인되었을 가능성과 전체 세포 중의 비율을 계산하기 위해 spiking한 양성 대조 세포(positive control cell)의 재배열을 모두 배제하여야 한다.
(2) Index sequence 선정 검사 결과 보고
결과 보고서에 포함되어야 할 주요 항목은 임상 정보, 검체 정보, DNA 양, 추정되는 총 유핵 세포 수, 각 유전자의 read count, index sequence 유무 및 비율, primer set 정보, V/J 유전자 조합, index sequence 서열이 있다. 현미경, 유세포분석, 면역조직화학 등을 통한 백혈병 세포 비율을 추가할 수도 있다. 선정된 index sequence의 대표성 여부 및 대표성이 적절히 높지 않을 경우 MRD 과소평가 가능성을 언급할 수 있다. 마지막으로 검사 방법, 선정 기준, 검사의 한계를 기술할 수 있다.
2 MRD 측정 검사 결과 해석과 보고
(1) 기존에 검출된 index sequence의 검출, 정량 및 해석
: 기존에 검출된 index sequence와 동일한 또는 허용되는 mismatch 범위 내의 재배열을 찾아 그 비율을 보고하며, 일반적으로는 전체 유핵 세포 중에서의 비율을 계산한다. 이 때에 검출한계와 최저정량한계를 고려하여 해석하여야 한다.
(2) 새로이 출현한 클론성 재배열의 해석
: 클론 진화에 의해 새로이 출현한 클론성 재배열이 관찰될 수 있다. 그러나, index sequence의 기준을 만족하 더라도 실제로는 B세포의 감소에 따라 다클론성 재배열이 index sequence의 기준을 만족할 수 있으므로 이를 배제할 방법을 마련하여야 한다. 한 예로 초진 또는 재발 당시 확인된 다클론성 재배열의 염기서열과의 일치 여부를 확인하고, 전체 유핵 세포에서의 비율을 함께 고려하는 방법이 있다.
(3) MRD 측정 결과 보고
: 결과 보고에 앞서 검출한계, 최저정량한계를 고려하여 보고 방식을 정한다. 가능한 널리 적용되는 예민도를 만족할 수 있는 검출한계, 최저정량한계를 확보하는 것이 중요한데, 예를 들면 소아 B-ALL은 0.01%, 성인 B-ALL은 0.1% 를 MRD 음성과 양성을 구별하는 기준으로 삼는 경우가 많다. 결과는 음성, 양성이나 정량 값 보고 불가, 양성이며 정량 값 보고 가능등으로 보고할 수 있다. 또한 검출한계 미만인 경우도 해당 index sequence의 read 수가 ‘0’이 아닌 경우에는 read 수를 참고할 수 있도록 함께 보고할 것인지 여부도 결정해야 한다.
보고서에 포함될 항목은 index sequence 선정 보고서의 항목을 포함하여, 추가로 index sequence 검출 여부 및 ( 전체 유핵 세포 중) 비율, MRD 판정 여부 등이며, 이전 검사 결과와 비교 시 시계열 데이터를 제시하고 이를 그래프로 표현하기도 한다. 마지막으로 검사 방법, 판정 기준, 한계 등이 포함될 수 있다.
본 권고안은 국내 임상검사실에서 시행하고 있는 ALL 환자 에서의 차세대염기서열분석 IG, TCR 유전자 재배열 검사를 이용한 MRD 검사의 결과해석 및 보고에 고려하고 갖추 어야 할 사항을 제시하여, 진료에 유용한 정보를 제공하고자 작성되었다. 다만, 이미 가이드라인으로 인정된 것을 종합한 내용이 아니기 때문에, 활용시에는 이를 염두에 두고, 각 검사실의 상황에 맞게 적용하여야 한다.
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