다이아제닉스
매년 9월 22일은 만성골수성백혈병(CML, Chronic Myeloma Leukemia) 환자들에게 완치의 희망을 주기 위해 지정된 ‘ 만성골수성백혈병의 날’이다. 최근 여러 임상에서는 CML의 치료목표로 완치 수준인 무치료관해(TFR, Treatment Free Remission) 도달을 제시하고 있다 1. 국내를 포함한 다수의 연구에서 상당수의 환자가 완치 수준인 TFR에 도달한 임상근거 들은 환자들에게 매우 희망적인 소식이 아닐 수 없다 2. TFR도달을 통해 약물 부작용 및 매일 약물을 복용해야 하는 번거로움을 덜어주어 환자의 삶의 질이 크게 개선될 수 있으며, 나아가 환자와 국가의 치료비 부담을 줄여줄 수 있는 등 많은 이점이 있다. 하지만 TKI치료중단은 재발 등의 부작용이 있을 수 있기 때문에 신중하게 고려되어야 하고, NCCN 가이드라인은 이를 위해 더욱 민감한 BCR::ABL1 정량검사와 더욱 잦은 모니터링을 권고하고 있다 3. 본 기고글에서는 NCCN 가이드라인을 포함한 BCR::ABL1 정량검사에 대한 여러가지 요구사항에 대해 살펴보고자 한다.
BCR::ABL1 정량검사에서의 고려사항
International Scale (IS) Calibrator의 유무
BCR::ABL1 정량검사는 오랫동안 각 실험실의 결과를 표준 화하기 위한 노력이 계속되어 왔다. 미국국립보건원(NIH) 은 BCR::ABL1 정량검사에서 International Scale (IS)을 사용할 것을 권고하였다 4 . 초기에는 Central Lab과의 검체 교환을 통한 실험실 고유의 변환계수(conversion factors) 를 제공하는 방법으로 결과를 표준화 하였으나, 검사결과의 일관성이 떨어지고 개별 CF값을 얼마나 자주 재검증해야 되는지 등에 대한 문제가 제기되었다 5. 이에, 각 실험실의 검사결과를 표준화하기 위해 WHO는 International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR::ABL mRNA을 제작하게 되었다. NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control)는 WHO의 표준물질의 공급이 매우 제한적이기 때문에 IS Calibrator가 포함된 Asuragen QuantideX® qPCR BCR::ABL IS Kit등의 상용화 제품을 사용하도록 권고하고 있다 6 .
International Scale (IS) Calibrator의 종류
상용화된 제품에 포함된 IS Calibrator는 크게 RNA와 DNA 두 종류로 나뉜다. RNA기반의 정량검사에서는 RNA Calibrator를 사용하는 것이 일반적이다. Calibrator가 RNA인 경우 검체와 동시에 동일 조건으로 역전사(Reverse Transcription) 및 중합효소연쇄반응(PCR) 과정을 거치게 되어, RT나 PCR 효율로 인한 bias를 최소화할수 있다. Asuragen사는 RNase에도 분해되지 않게 RNA를 안정화하는 고유기술인 Armored RNA기술을 활용하여 RNA형태의 IS Calibrator를 생산하여 제품에 포함하고 있다. Abbott나 Roche 또한 HIV, HCV 검사에서 Asuragen의 Armored RNA기술을 통해 RNA-based calibrator를 제작한다.
International Scale (IS) Calibrator의 개수
FDA는 BCR::ABL 정량검사에 대한 허가심사 가이드라인에서 반드시 Multipoint Calibrator를 포함하도록 규정 하고 있다 7. Calibrator를 1개만 사용하는 경우 [그림1]과 같이 Ct값에 따라 IS 값의 편차를 유발할 가능성이 있다. Multipoint Calibrator를 사용하면 모든 범위의 Ct값에서 일관된 IS 결과를 얻을 수 있다. Asuragen QuantideX® qPCR BCR::ABL IS Kit는 WHO의 표준물질과 동일하게 4개의 IS Calibrator를 키트에 포함하고 있다.
그림 1
국제 가이드라인 민감도 기준
NCCN가이드라인은 TFR도달로 인한 TKI치료중단의 개념이 도입되면서 BCR::ABL정량검사에 대한 요구사항을 구체적으로 제시하였다 3. DMR (MR4.0 or BCR::ABL1≤0.01% IS)을 2년 이상 유지한 환자에서 TKI치료중단을 고려하되, 이 경우 검사결과를 2주안에 제공할 수 있어야 하고 특히 민감도가 최소 MR4.5 (BCR::ABL1≤0.0032% IS)이상인 qPCR검사를 하도록 권고하였다. 또한, TKI치료를 중단한 직후 6개월 간은 매달, 이후 6개월은 두 달에 한번, 이후에는 세 달에 한번 검사를 하고, 이 기간 중 MMR (MR3.0 or BCR::ABL11≤0.1% IS)을 유지하지 못한 경우 다시 MMR 에 도달하기까지 매달 검사할 것을 권고하였다. 다시 말해 NCCN가이드라인은 민감도가 MR4.5이상으로 매우 높고, 검체처리량 및 처리속도가 우수한 제품을 요구한다. Asuragen의 Quantidex BCR::ABL IS 제품은 5개 기관이 참여한 다기관 임상에서 1,687개의 Human RNA 임상검체 에서 95% 신뢰구간 내에서 MR4.7의 매우 높은 민감도를 입증하였다 8. 제조사에서 주장하는 민감도가 Cell Line으로 측정한 결과인지, 임상검체에서 측정한 결과인지도 참고할만하다.
검사 편의성 1 (Singleton검사)
BCR::ABL1 정량검사에서 검사자의 편의성에 영향을 줄 수있는 검사방법의 첫번째 특징은 Singleton 검사여부이다. Duplicate검사의 경우 시약사용량이 두배로 증가함은 물론 검체를 나누어 분주하는 과정이 추가된다. Singleton 검사 결과의 신뢰성을 담보하기 위해서는 반드시 검사결과의 정확도와 재현성이 검증되어야 한다. Asuragen의 Quantidex BCR::ABL IS Kit는 Multisite Precision 실험 (arm1: n= 3 sites x 5 days x 25 samples x 2 replicates = 750) (Arm2: n=3 operators x 3 runs x 25 samples x 2 replicates = 450)에서 1,200개의 Replicate 검사에서 [표1]과 같이 매우 높은 정확도와 재현성을 보였다 8.
검사 편의성 2 (Multiplex디자인)
검사자의 편의성에 영향을 줄 수 있는 검사방법의 또다른 특징은 Multiplex PCR 여부이다. BCR::ABL1과 ABL1을 Singleplex PCR하는 경우 시약사용량이 두배로 증가함은 물론 분주 과정이 추가된다. 뿐만 아니라 BCR::ABL1과 ABL1의 역전사 및 중합효소연쇄반응이 다른 Well에서 이루어지게 되므로 검사자의 매우 정교한 Pipetting이 요구 된다. Multiplex PCR의 경우 BCR::ABL1과 ABL1의 RT 및 PCR이 같은 Well에서 같은 조건으로 이루어지게 되어 결과의 정확도 뿐만 아니라 사용자 편의성도 개선할 수 있다.
그림 2
qPCR vs digital PCR
BCR::ABL1 정량검사에서 특별하게 고려해야할 점은, 결과값이 상대정량값(MR or %IS)으로 제공되야 한다는 점이다. NCCN가이드라인은 qPCR검사를 하도록 권고하고 있고, 국내에 급여화 되어 처방되는 TKI치료제 imatinib(1 세대), dasatinib(2세대), nilotinib(2세대), bosutinib(2세 대), radotinib(3세대), ponatinib(3세대), ascinimib(4세 대) 모두 qPCR검사결과를 기반으로 허가를 받은 치료법이다. Digital PCR은 일반적으로 검사비용이 qPCR에 비해 비싸고 검사과정이 복잡하며 시간당 검체처리량이 낮은 단점이 있다. 나아가 현재까지 BCR::ABL1에서 digital PCR 검사가 qPCR검사보다 민감도가 높다는 실험적 근거는 없다. 상용화된 ddPCR.검사는 분석적성능실험에서 Asuragen의 Quantidex BCR::ABL IS Kit과 동일한 MR4.7의 민감도를 보였다 9 여러 종류의 ddPCR검사법을 비교한 연구에서는 ddPCR은 음성검체에서 위양성을 나타내었다 10.
표 1
요약 현재 국내에는 8개 회사의 제품이 BCR::ABL1 정량검사에 식약처의 수입 혹은 제조허가를 받았고(2024년8월기준), 각 제품마다 검사방법이나 분석적성능 등 각기 다른 특징을 갖고 있다. 검사법의 선택에는 여러가지 고려사항이 있을 수 있다. 대표적인 고려사항을 정리하면 IS Calibrator 의 종류 및 개수, 임상지침에서 요구하는 민감도 충족여부, 사용자 편의성(Multiplex, Singleton design) 등이 있다. Asuragen의 Quantidex BCR::ABL IS Kit는 이러한 고려 사항을 모두 충족하는 제품으로 FDA에서 허가를 받은 최초의 제품이며 국내에서는 2024년 4월에 식약처의 수입 허가를 받았다.
그림 3
표 2
[References]
[1] Hughes TP, Ross DM. Moving treatment-free remission into mainstream clinical practice in CML. Blood. 2016;128(1):17-23.
[2] Park S, Choi EJ, Lee H, et al. Treatment-free remission of chronic myeloid leukemia in real-world practice by the detection limit of MR4.3. Leuk Res. 2021;105:106578.
[3] NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology, Chronic Myeloid Leukemia (version 3.2022).
[4] Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood. 2006;108(1):28-37.
[5] White HE, Matejtschuk P, Rigsby P, et al. Establishment of the first World Health Organization International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR-ABL mRNA. Blood. 2010;116(22):e111- e117.
[6] https://www.nibsc.org/science_and_research/advanced_therapies/genomic_reference_materials/bcr-abl_(who).aspx
[7] FDA, 21CFR866.6060
[8] Brown JT, Beldorth IJ, Laosinchai-Wolf W, et al. Analytical Validation of a Highly Sensitive, Multiplexed Chronic Myeloid Leukemia Monitoring System Targeting BCR-ABL1 RNA. J Mol Diagn. 2019;21(4):718-733.
[9] Shelton DN, Bhagavatula P, Sepulveda N, et al. Performance characteristics of the first Food and Drug Administration (FDA)-cleared digital droplet PCR (ddPCR) assay for BCR::ABL1 monitoring in chronic myelogenous leukemia. PLoS One. 2022;17(3):e0265278.
[10] Alikian M, Whale AS, Akiki S, et al. RT-qPCR and RT-Digital PCR: A Comparison of Different Platforms for the Evaluation of Residual Disease in Chronic Myeloid Leukemia. Clin Chem. 2017;63(2):525-531.
