국민건강보험 일산병원
분자유전검사는 검사 의학에서 가장 빠르게 성장하는 분야 중 하나로 초기에는 단일 목표를 확인하거나 양을 측정하는 검사가 널리 사용되었지만 최근에는 다중 분석이 보편화 되었다. 다중 분석은 검체 준비, 신호의 증폭, 검출 및 해석의 과정에서 두 가지 이상의 표적을 동시에 검출하는 것으로 정의할 수 있다. 검사실에서 새로운 다중 분자유전검사법을 도입할 때에는 환자에게 사용하기 적절한 검사성능을 가지고 있는지 ‘검정’할 필요가 있다. 흔히 검증(validation)과 검정(verification)을 혼동하기 쉬운데, ‘검증’은 특정 요구사항이 의도된 용도에 적합한 확인으로 주로 시험 개발자가 수행하는데 반해 ‘검정’은 특정 항목이 특정 요구사항을 충족한다는 객관적 증거의 제공이 목적으로 검사실의 검사자가 시행하게 된다.
다중 분석은 복수의 측정량을 대상으로 하므로 고유한 측정량에 대한 검증이나 검정으로 접근하는 것은 때로는 불가능할 수 있다. 따라서 통상적으로 별도의 검사 단계를 독립적으로 평가하여 각 검사 단계의 성능에 영향을 미치는 핵심 요인을 주의 깊게 검토하는 오류기반 평가를 주로 이용한다. CLSI의 MM17 ‘Validation and Verification of Multiplex Nucleic Acid Assays’ 2판에서는 다중 분자유전검사의 검증 및 검정의 지침을 담고 있는데, 여기에서는 병원체 검출을 위한 다중분자유전검사의 검정 지침에 적용할 수 있는 내용을 소개하고자 한다.
1. 병원체 검출을 위한 검체
미생물 감염은 세균, 바이러스, 결핵균, 진균 및 기생충에 의하며, 이를 진단하기 위해서는 전혈, 혈장, 혈청, 객담, 코 세척물, 비인두 면봉 검체, 비강흡인, 기관지폐포 세척, 기관 내 흡인, 자궁 경부 및 요도 면봉 검체, 뇌척수액, 배양 세포, 소변, 대변, 및 미생물 분리주 등의 다양한 환자 검체에서 DNA나 RNA를 추출하게 된다. 효과적인 감염진단을 위하여 감염위치, 감염체의 병원성 및 병원체 농도에 따라 적절한 검체의 종류를 선택해야 한다. 이때는 DNA와 RNA 바이러스의 중복감염과 집락화된 상재균의 존재를 고려해야 한다.
검정을 위한 검체 선택시 일반적으로 환자 검사용과 동일한 검체를 사용하며 검정하는 것이 추천된다. 또한 다중 분석에 적합한 핵산을 제공할 수 있도록 검정 과정에서 검체수송 도구 내 항응고제, 방부제 또는 안정제와 검체의 보관 및 배송 조건을 확인해야 한다. 병원체 검출을 위한 검체는 병원성을 알 수 없기 때문에 표준지침을 지켜 안전하게 취급하는 것이 중요하다.
2. 핵산의 추출
자동화 장비를 사용할 경우 잠재적 잔효(carry over)와 오염의 문제를 고려해야 한다. 잔효를 줄이기 위해서는 에어로졸 장벽이 있는 일회용 팁, 일회용 플레이트 및 밀봉된 시약 카트리지와 같은 핵산 추출용 시약을 사용한다. 사용하기 전 추출 키트에 다중 핵산 검사에 포함된 표적이 존재하는 지 시험할 필요가 있다.
추출에서 얻은 핵산의 양과 순도는 다중 분석에서 매우 중요하므로 A260/A280 비율로 순도를 측정하고 형광 시약을 사용하여 정량화 한다. 핵산은 추출 과정과 보관 중에 분해되기 쉽기 때문에 반복적인 동결 해동을 피하고 장기간 보관 후에는 사용하기 전에 한천겔의 전기영동 등으로 핵산의 무결성(integrity)를 평가한다.
3. 정도관리검사
검사 성능을 추적할 때 적절한 정도관리를 포함해야 하며, 내부 정도관리와 외부 정도관리를 서로 보완하여 사용한다. 내부 정도관리에 실패하는 원인으로는 장비 오작동, 최적화되지 않은 시약, 반응 웰에 존재하는 중합효소 활성도 및 검체 매트릭스 내 억제 물질 등이 있다.
4. 분석적 성능 검정
정확도(Accuracy)는 참고방법(reference method)으로 양성과 음성이 결정된 최소 20개 양성 및 10개 음성 검체를 포함한 총 30개 이상의 검체로 검사한다. 잘 확립된 참고방법이 없는 경우, 음성 검체에 참고물질을 첨가한 스파이크 검체를 사용할 수 있다. 민감도는 진양성 /(진양성 + 위음성) • 100으로 계산하고, 특이도는 진음성/(진음성 + 위양성) • 100으로 계산한다.
정밀도(Precision)의 측정은 정량적인 결과가 숨어 있는 정성적 시험의 경우 평균, 표준편차 및 변이계수를 측정한다. 최소검출농도 부근의 농도, 중간 농도, 고농도를 사용하여 매일 각 표적에 대한 중복 검사의 평균을 구한다.
검출한계(limit of detection)는 통계적으로 배경 또는 음성 검체와 구별할 수 있는 가장 낮은 측정량으로 분석물을 포함하는 검체의 95 %가 양성을 보이는 농도로 추정한다.
간섭(Interference)의 평가시 관심 있는 측정치 농도는 감염성 질환 분자유전 분석에서 보고 가능한 범위 중 가장 낮은 농도로 하고, 간섭 물질은 실제 검체에 있을 것으로 예상하는 최고 농도로 한다. 이를 위하여 잠재적으로 반응하는 물질을 스파이크한 정도관리 물질로 시험할 수 있다.
5. 참고치(reference value)
병원체는 정상 모집단에서 검출되지 않으므로 참고치는 별도의 평가가 없이 ‘검출 없음’으로 한다.
6. 임상적 성능 검정
임상적 타당성 및 효용성을 확립하기 위한 것으로 검사실 책임자의 재량으로 수행할 수 있다. 양성과 음성 환자의 차트의 검토를 포함하며, 이에 영향을 미치는 중요한 변수로는 표적의 지역 유병율, 숙주 요인 및 감염성 질환의 집단발병이 있다. 임상적 검정이 현실적으로 어려운 경우 동료간 심사를 거친 간행물을 이용할 수 있다.
7. 검정 자료의 판정
검정 평가의 요약에는 분석의 설계, 수행된 연구 및 관련된 결과를 간략하게 제시해야 하며, 때 검정의 수락 기준은 미리 검사실에서 정립하는데, 예를 들면 검정 중인 시험과 기준 시험 사이의 일치도를 각 표적과 모든 표적에 대해 90% 이상으로 사용할 수 있다. 모든 측정량에 대한 허용 가능한 성능을 입증하는 것은 불가능 할 수 있으며, 일부 측정량의 성능이 불량한 경우 환자군에서 임상적 유의성과 기대 효과 내에서 성능 평가를 해석해야 한다.
[참고문헌]
Clinical and Laboratory Standards Institute, MM17 Validation and Verification of Multiplex Nucleic Acid Assays (2nd edition)
https://clsi.org/standards/products/molecular-diagnostics/documents/mm17/(Update 2021. May)
