저자들은 부모 세대(P generation)에서 4가지 다른 타입의 초파리를 교배하였다: 2가지 D. simulans (각각 siI과 siII의 mitotype을 가짐)를 모계로, 2가지 D. mauritiana (각각 maI과 maII의 mitotype을 가짐) 부계와 교배하여 아래 표와 같이 4가지 잡종을 만들었다.

4가지 잡종을 다시 D.simulans 암컷 혹은 D.mauritiana 수컷과 교배시켰다. 어떤 개체는 교배에 실패하였으므로 각 잡종 타입별 개체수는 상이하다. 이 과정을 각 모체마다 4회씩 시행하여, 수정 당시 모계 연령(very young, young, old, very old)에 따른 4가지 F1 잡종이 존재하게 된다. simulans x mauritiana 교배는 가임(可妊) 암컷과 불임 수컷을 생산했다. 모든 F1 수컷을 에탄올로 보존하고 모든 F1 암컷을 아래 그림과 같이 D.simulans (P세대의 D.simulans와 다른 mitotype을 가짐)과 교배하였다.

F1의 모든 heteroplasmy가 paternal leakage에서 기인한 반면, F2의 heteroplasmy는 paternal leakage와 maternal inheritance 두 가지 기전으로 발생할 수 있으므로(그림 참조) F1 암컷을 D.simulans (siII)수컷과 역교배시켰다. 10개의 heteroplasmic F1 가계와 10개의 homoplasmic F1 가계가 있었고, 역교배로 각 가계에서 390 개체의 F2를 얻었다(총 780 마리). F2 개체를 대상으로 가계 별 heteroplasmy 발생률에 차이가 있는지 분석한 결과, 가계에 따라서 F2의 heteroplasmy 발생 빈도가 유의하게 차이남을 알 수 있었으며(p<0.000099). 모체의 heteroplasmic 상태가 paternal leakage에 영향을 미치는지 분석한 결과, homoplasmic F1 모체에서 paternal leakage에 의한 F2의 heteroplasmy 발생이 유의하게 많이 발생함을 알 수 있었다(p=0.00009). F2의 heteroplasmy가 P 모체에 따라 발생률의 차이가 있는지 분석한 결과 유의한 차이가 있었다 (p=0.000013). F1 모체의 heteroplasmy state와 F2 자손의 heteroplasmy 발생 빈도는 hetero/homo F1 모체에 따른 차이가 없었으며(p=1), 이는 homoplasmy F1이라고 생각했던 F1 암컷이 LoD 이하의 paternal mtDNA를 가지고 있어, 후세대로 전달하였음을 시사한다. Heteroplasmy의 모계 유전과 paternal leakage가 독립사건인지 분석한 결과는 F2 개체를 전체로서(pooling) 분석할 경우 두 군 간에 차이가 없었지만(p=1), 가계 별로 나누어 분석한 경우, 모계유전된 heteroplasmy를 가진 개체에서 paternal leakage에 의한 heteroplasmy 발생이 유의하게 높았다(p=0.0299).

본 연구에서 heteroplasmy 발생률은 가계에 따라 유의하게 차이가 난다는 것과, heteroplasmy 발생률이 높은 가계에 paternal leakage와 maternal inheritance 기전이 둘 다 관여한다는 점을 알 수 있었다. 이것은 유전 성분이 heteroplasmy 발생을 조절한다는 점을 시사하며, 수정 시 정자의 사립체를 파괴하는 과정이 무작위가 아니라는 점을 시사한다. 예를 들어, 수정 당시 모체의 연령이 증가할수록 paternal leakage가 더 빈번하게 관찰되었으며, 이전에 사람을 대상으로 한 다른 연구에서도 동일한 내용이 보고되었다. 이는 아마도 uniparental transmission에 관여하는 유전자에 체세포변이가 축적되기 때문이라 생각된다. 기존에 초파리를 이용한 비슷한 연구들에서 상기 두 과정이 무작위라는 결론이 많았는데, 가계를 분리하지 않고 초파리 개체 간 비교만 시행하였기 때문에 본 연구결과와 상충되는 결론이 나온 것으로 생각된다. 한 번 후세대로 전달된 heteroplasmy가 지속적으로 다음 세대로 전달되는지에 대해 저자들은 ‘strong heteroplasmy’와 ‘weak heteroplasmy’의 두 가지 특성이 존재한다고 가정하는데, F1에서 관찰된 heteroplasmy origin의 D.mauritiana : D.simulans가 1:1인 반면, F2에서 그 비율이 1:3으로 전달되기 때문이다. 이러한 ‘strong’ 패턴이 가계별 heteroplasmy 발생 빈도 차이와 관련이 있으며, 다른 논문에서 제시한 nuclear genetic contents의 피드백 및 epigenetics 기전이 관여할 것으로 생각된다. 또한 heteroplasmy 발생률이 높은 가계의 개체가 3가지 이상의 mtDNA의 heteroplasmy를 나타낼 가능성을 시사하였다.

본 연구는 초파리를 가계에 따라 분류하고 각 초파리에게 ID를 부여하여 분석함으로써(원 논문 참조) 기존 연구에 비해 좀 더 유의한 결과를 얻을 수 있었다. 본 연구는 방법론적으로는 SSP-PCR 후 GE가 F1에서 절반 가량의 heteroplasmy를 놓칠 정도로(suspicious false negative) 퍼포먼스가 좋지 않았다. 그럼에도 불구하고, 664 건의 교배를 시행하고, 2,162 마리의 초파리에게 식별번호를 부여하여 기록한 결과, IF 3.998의 저널에 등재되는 쾌거를 이룩한 점에서 가난한 연구자들에게 노오력의 중요성을 알려주었다. 또한, 본 연구가 필자가 임상검사실에서 mtDNA를 해석하는 데 직접적인 도움을 주지는 못했지만, 3 PHP 불일치에서 ‘친족 관계를 배제할 수 없을’ 때 느끼는 죄책감은 확실히 덜어주었다.