TECHNOLOGY TREND

Ion AmpliSeq SARS-CoV-2 panel을 이용한 코로나19 바이러스의 Whole Genome Sequencing

Focus on 사용자 경험
Thermo Fisher Scientific

2020년 전 세계를 휩쓴 COVID-19 사태는 2021년 현재도 수많은 감염자와 사망자를 낳고 있다. 2020년 말부터 코로나19 바이러스인 SARS-CoV-2의 백신 접종이 시작되었고, 일부 대량 접종이 진행된 국가들은 예상보다 훨씬 좋은 효과를 보였다[1]. 예를 들어, 미국 CDC의 5월 25일 보고서에 따르면 2021년 1월부터 4월 30일까지 미국에서 코로나19 백신 접종을 완료한 사람은 약 1억 100만 명이었고, CDC가 각 주 등의 보건당국 데이터 기반으로 집계한 결과, 접종 후 감염이 보고된 사람은 약 0.01%에 불과한 10,262명으로, 입원 995명, 사망 160명이었다. 실제 감염자 수는 더 많을 가능성도 있지만, 이 결과는 백신이 충분히 효과적이라는 결론을 내릴 수 있다[2].

하지만, SARS-CoV-2는 지속적으로 변이형이 발견되고 있으며, 이에 따라 백신의 효능이 저하될 우려가 있다. 2020년 12월, 영국 보건국은 소위 영국변이로 알려진 코로나19 변이주 B.1.1.7을 보고하였고 이는 기존 코로나19 바이러스보다 감염력이 더 높다고 알려져 있다. 현재 WHO, CDC, 영국 보건국 등은 우려 대상인 코로나19 주요 변이 바이러스를 VOC (Variants of Concern), 관심을 두고 관찰 중인 기타 변이 바이러스는 VOI (Variant of Interest)로 분류하며 2021년 5월 31일 기준 주요 변이 바이러스 정보 및 관련 변이는 아래 표와 같다. (WHO, Tracking SARS-CoV-2 variants, https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/)

이름 WHO label 주요 변이 바이러스의 Spike Protein 변이 최초 발견지
B.1.1.7 Alpha 69/70del, 144del (E484K), (S494P), N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I,S982A, D1118H, (K1191N) United Kingdom
B.1.351 Beta D80A, D215G, 241/242/243del, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V South Africa
P.1 Gamma L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I Japan/Brazil
B.1.427 Epsilon L452R, D614G US-California
B.1.429 Epsilon S13I, W152C, L452R, D614G US-California
B.1.617.2 Delta T19R, (G142D), 156-157del, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, D950N India
표 1. 코로나19 바이러스의 S (spike) 유전자 영역 변이 중에서 단백질 아미노산이 바뀐 정보를 기반으로 변이 바이러스를 분류. 괄호는 일부에서 발견되는 경우.

현재까지 알려진 변이형과 새로운 변이형을 모두 확인할 수 있는 대표적인 방법은 NGS (Next Generation Sequencing)이며, 써모 피셔는 코로나19 바이러스의 Whole Genome Sequencing을 지원하는 Ion AmpliSeq SARS-CoV-2 research panel을 선보였다. 이 패널은 30kb 정도인 SARS-CoV-2 유전체의 99% 이상을 포함하는 247개 amplicon과 human gene expression controls인 5개 amplicon으로 구성되며, 1-10 ng의 total RNA 또는 5-10 ng의 cDNA를 사용한다. Ion Torrent의 대표적인 차세대 시퀀서인 Ion S5 또는 Ion GeneStudio S5 시리즈에서는 cDNA를 준비 후 Ion Chef로 라이브러리를 자동으로 만들 수 있으며 template 준비와 칩 로딩도 가능하다. 시퀀서에 들어가는 Ion 530 chip은 한 번에 15~20개 검체를, Ion 540 chip은 60~80개 검체를 동시에 분석할 수 있다. 2020년에 출시된 최신형 전자동 시퀀서인 Ion Torrent Genexus integrated sequencer는 바이러스 RNA만 넣으면 cDNA 역전사부터 모든 NGS 과정을 자동으로 수행하며 24시간 안에 분석 리포트까지 완료할 수 있다. 한 번의 run으로 16개 검체를 동시에 처리할 수 있으며, Genexus의 GX5 chip은 32개 검체까지 가능하다. 또한 Genexus는 칩과 시약을 장비에 세팅하고 2주 동안 보관 가능하며 최대 4번에 나누어 시퀀싱을 시행할 수 있기 때문에 검체를 8개씩 4번에 걸쳐 run하거나 16개씩 2번 run하는 등 검사실의 상황에 맞추어 이용할 수 있다.

그림 1. cDNA 역전사부터 최종 리포트까지 전체 과정이 자동화된 유일한 NGS 시스템인 Ion Genexus 시퀀서의 SARS-CoV-2 research panel 시퀀싱 작업 흐름.

SARS-CoV-2 research panel을 위한 3개의 소프트웨어가 무료로 제공되며 자동 분석도 가능하다. 기본 mapping과 variant calling 후 SnpEff, IRMA, TRINITY 3개의 plugin 소프트웨어로 각각 SARS-CoV-2 바이러스 변이의 annotation, consensus 서열 생성, de novo assembly가 가능하다. 예를 들어, SnpEff 분석에서는 유전자의 염기서열의 변이와 아미노산 변이 정보가 제공되므로 변이형 바이러스 판독도 가능하다.

써모 피셔는 SARS-CoV-2의 수십 여개 변이를 검출할 수 있는 Real-time PCR probe와 Sanger sequencing을 이용한 프로토콜, S 유전자 전체를 sequencing 할 수 있는 primer 등을 공개하였다. 그러나 바이러스 변이형에 대한 우려가 높아지고 앞으로 발생할 변이형을 발견, 추적 관찰하기 위해서는 NGS를 기반으로 한 검사법이 필요하다. Ion Torrent 시퀀서를 이용한 Ion AmpliSeq SARS-CoV-2 research panel과 연관 소프트웨어들은 바이러스 시퀀싱이 처음이거나 NGS 자체가 처음인 많은 연구소와 병원들도 코로나19 사태에 적극적으로 대처할 수 있는 강력한 수단이 되고 있다[4][5][6][7]. 지난 2월에 일본의 야마나시 현립중앙병원은 Ion Genexus를 도입했고, 지역 내 최초로 SARS-CoV-2 Gamma 변이형을 확인할 수 있었다[8]. 올해 5월 MAKO Medical은 미국 CDC와 COVID-19 시퀀싱 파트너십 구축을 구축하였으며, 현재까지 25개 주의 바이러스 변이형을 확인했고 최대 주당 20만 개 검체까지 시퀀싱을 시행할 수 있다[9]. 코로나19 사태는 매우 비극적인 상황이지만, 인류 역사상 최초로 바이러스 실시간 분석 기반의 대응체계를 수립한 사례로도 기록될 것이다.

그림 2. cDNA 역전사부터 최종 리포트까지 전체 과정이 자동화된 유일한 NGS 시스템인 Ion Genexus 시퀀서의 SARS-CoV-2 research panel 시퀀싱 작업 흐름.

[참고문헌]

[1] Eric J Haas et al., The Lancet 397, P1819-1829 (May 2021) Impact and effectiveness of mRNA BNT162b2 vaccine against SARS-CoV-2 infections and COVID-19 cases, hospitalisations, and deaths following a nationwide vaccination campaign in Israel: an observational study using national surveillance data.
[2] COVID-19 Vaccine Breakthrough Infections Reported to CDC — United States, January 1–April 30, 2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. ePub: 25 May 2021. DOI: https://www.cdc.gov/mmwr/volumes/70/wr/mm7021e3.htm
[3] https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/959438/Technical_Briefing_VOC_SH_NJL2_SH2.pdf
[4] https://thewell.unc.edu/2021/03/19/tracking-sars-cov-2-variants/)
[5] https://newschannel9.com/news/local/baylor-school-lab-uses-new-machine-to-detect-variants-as-new-cases-detected-in-tennessee
[6] https://newschannel9.com/news/local/baylor-school-lab-shows-evidence-that-covid-19-vaccines-help-combat￾variants
[7] https://www.washingtonpost.com/graphics/2020/national/genetic-science-coronavirus-outbreak-iowa/
[8] https://www.nikkei.com/article/DGXZQOFB111ST0R10C21A2000000/
[9]https://www.globenewswire.com/en/news-release/2021/05/13/2229380/0/en/MAKO-Medical-Forges-partnership-with-the-CDC.html

TOP