세브란스병원
환자의 진단 및 추적관찰을 위하여 분자유전 검사법을 이용한 임상 검사의 사용이 점차 증가하고있다. 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 타겟 유전자 혹은 특정 변이의 정량 검사는 병원체 혹은 종양 세포의 검출 및 정량, 치료 반응 평가, 미세잔존질환 (minimal residual disease)의 추적 관찰에 유용하다. 실시간 중합효소연쇄반응법 (real-time PCR) 은 민감도와 특이도가 높으며, 상대적으로 낮은 비용과 짧은 검사 소요시간으로 인해 타겟 핵산 분자의 정량을 위해 현재 가장 널리 사용되는 기법이다. 또한 높은 확장성 및 유연성 때문에 다양한 타겟을 대상으로 하는 임상 검사에 적합한 방법이다. 최근에는 표준곡선 (standard curve)를 사용하지 않고도 절대 정량이 가능한 디지털 PCR (digital PCR) 이 도입되어 연구는 물론 임상 검사 영역에서도 활용도가 높아지고 있다.
새로운 분자유전 검사법을 임상 검사실에 도입할 때 적절한 검정 (verification) 절차의 수행이 중요하다. 검정이란, 기존에 제시된 검사 성능 정보가 해당 검사실에서 재현될 수 있는지 확인하는 과정이다. 체외진단의료기기 (In-vitro diagnostics devices, IVD)의 경우 제조사에서 제시한 성능 정보를 확인하는 과정에 해당하며, 혹은 검사실에서 수행하고 있는 동일한 기법 (예, 염기서열분석)을 사용하여 새로운 유전자를 추가 할 때 기존 유전자에 상응하는 검사 성능을 보이는지 검증하는 과정도 이에 해당한다. 상대적으로 개별 검사의 건수는 적으며 수기 과정이 많은 분자유전 검사법의 경우 건수가 많고 자동화된 검사에 비하여 표준화된 검정 지침을 적용하기 어려운 경우가 많다. 검사의 특성 (예, 정성과 정량 검사법)에 따라 적절한 검정 항목을 선택해야 하며, 본문에서 정량 분자유전 검사법의 검정 항목 및 절차에 대해서 제안하고자 한다.
1. 정확도 (Accuracy)
정확도는 분석 물질의 참값과 검사 결과의 일치도를 평가하는 과정이다. 정확도 평가를 위한 물질은 표준 방법 혹은 다른 방법으로 측정하여 농도를 아는 검체나 표준물질을 사용할 수 있다. 사용하는 물질의 농도 범위는 검사의 보고 범위 (reportable range) 전체에 골고루 분포하도록 선택하는 것이 바람직하다. 적절한 물질의 개수에 대해서는 검사의 난이도, 검사 대상집단에서 타겟 변이의 빈도, 기준 방법의 정확도가 확립되었는지, 제조사의 지침에서 변경하여 시행하는 사항이 있는지 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 결과의 평가는 기준 검사 결과와 평가 검사 결과 사이의 차이를 분석하여 판정하며, 평균 편향 (average bias)이 사전에 설정된 허용 기준 (allowable limit) 내에 드는지 평가하는 방법이나, t-test나 회귀 분석을 이용할 수 있다.
2. 정밀도 (Precision)
정밀도는 규정된 조건에서 반복적으로 수행된 검사 결과 값들 간에 일치도를 평가하는 과정이다. 임상 검체나 표준 물질을 사용 가능하며, 최소 2~3개의 샘플로 수행이 권장된다. 농도의 선택에 있어서는 cutoff 나 참고 한계 (reference limits) 등 임상적으로 중요한 농도나, 검출한계 (limit of detection) 혹은 정량한계 (limit of quantification)를 고려하여 결정할 수 있다. 같은 물질을 동일한 수행 (run)에 반복측정하여 반복정밀도 (repeatability)를 평가하며, 며칠에 걸쳐 여러 번의 run에 반복측정하여 총부정확도 (total imprecision)를 평가할 수 있다. 결과는 반복 측정값의 평균과 표준편차 (standard deviation, SD), 변이계수 (coefficient of variation, CV)를 계산하여 제조사에서 제시하는 값이나 임상적으로 허용 가능한 변동값 기준으로 평가할 수 있다.
3. 직선성 (Linearity)
직선성은 검사 결과 값이 분석 물질의 농도에 비례하는 범위를 평가하는 과정이다. 임상 검체나 표준 물질을 사용 가능하며, 물질의 농도 범위는 제시된 직선성 범위 전체에 분포하도록 최소 5개의 농도를 사용하는 것이 권장된다. 농도 당 2~4회 반복 측정을 수행하며 하나의 분석 물질에 대한 검사 수행은 하루에 완료하는 것이 좋다. 검사실에서는 분석 물질마다 측정의 허용오류 (allowable error) 목표 값을 설정해야 하며, 임상 지침 내의 요구 조건, 생리적 변이 (physiological variation), 문헌자료, 외부정도관리 판정기준 등을 참고하여 설정할 수 있다.
4. 참고 구간 (reference interval)
참고 구간은 건강인 혹은 정상인 검사대상군에서 예상되는 검사 결과 값의 범위를 의미한다. 추적관찰 목적으로 정량 분자유전 검사법이 많이 이용되는 혈액종양 유전자검사의 경우, 변이의 음성 결과 값이 참고치가 되나, 정상인에서 BCR-ABL1 등 융합 전사물질의 검출과 관련된 보고들이 있으며, 클론성조혈증 (clonal hematopoiesis of indeterminate potential, CHIP)과 관련된 변이의 가능성도 고려가 필요할 것이다.
[참고문헌]
1. Measurement procedure comparison and bias estimation using patient samples. CLSI guideline EP09c. In: Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne, PA, 2018.
2. Quality management for molecular genetic testing. CLSI guideline MM20-A. In: Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne, PA, 2012.
3. Evaluation of Linearity of Quantitative Measurement Procedures. CLSI guideline EP6-A. In: Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne, PA, 2003.
