현재 신이식 환자에서 거부반응 예측을 위해 사용하는 모니터링 검사 (혈장 크레아티닌, 면역억제제 혈중 농도, 단백 뇨, 혈뇨, 공여자 특이 항체(DSA), 초음파 촬영 등)는 이식 거부반응에 특이적이지 않고 거부반응의 조기예측이 어렵 다. 생검은 침습적인 방법으로서 약 1%에서 주요 합병증이 발생하고, 3.5% 이상에서 혈뇨가 발생할 위험이 있으며, 약 25%에서 부적절한 표본으로 진단이 어려울 수 있다. 또한 무증상 거부반응 (Subclinical rejection) 배제 및 생검 시기 결정에 도움을 줄 수 있는 혈액검사가 필요하다.

이식편 손상 (거부반응, 급성 세뇨관 괴사, 허혈, 외상, 감 염 등)으로 인해 이식세포사멸에 의한 nucleosome에 의한 cfDNA이 혈류로 방출되는데, 괴사 (necrosis)에 의해 ~10,000bp 크기, 세포사멸 (apoptosis)의 의해 50-500bp 크기의 cfDNA가 방출되며 반감기는 30분-2시간 이다. 이식환자의 혈액에서 검출되는 공여자 유래 cfDNA (dd-cfDNA)는 장기손상, 거부반응, 무증상 거부반응, 이식실패에서 증가하며, 치료에 대한 반응을 반영한다 (Figure 1). 그러나, dd-cfDNA는 환자 혈액의 총 cfDNA 중극히 일부이며, 이식된 장기에 따라 거부반응 검출을 위한 dd-cfDNA%는 다르게 보고되어 있어 해석에 주의가 필요 하다.

<그림1> dd-cfDNA as a transplant biomarker. (A) Increases in DNA derived from the donor organ were observed following organ damage. Increases are also observed in subclinical disease. (B) Measuring dd-cfDNA levels in transplant recipients longitudinally to screen for: (1) subclinical disease, (2) clinical disease, (3) response to treatment and (4) graft failure [figure from [1] Edwards, R. L., et al. (2022). Biomark Med 16(5): 401-415.]

초기 dd-cfDNA의 검출은 남성 공여자의 장기를 이식받은 여성수혜자의 혈액에서 Y 염색체 DNA를 확인하였다. 이후 HLA 유전자형에 기반한 PCR 방법이 소개되었으나, 이는 공여자와 수혜자의 HLA typing 결과가 동일한 경우에는 구분이 어렵다.

최근 이용되고 있는 dd-cfDNA 정량화는 수혜자와 공여자의 이종 대립유전자를 구별할 수 있는 유전자 마커(예: 단일 염기다형성 (single nucleotide polymorphisms, SNP) 를 기반으로 한다. 이식 환자의 혈장검체에서 cfDNA를 추출한 후 공여자유래 cfDNA (dd-cfDNA)구분을 위해서, 선별된 SNP 마커를 증폭하고 정량PCR (qPCR), 차세대 염기서열분석 (NGS), digital droplet-PCR (dd-PCR) 등으로 정량 분석하여 총 cfDNA에 대한 dd-cfDNA 비율 (dd-cfDNA%) 또는 총 cfDNA 와 dd-cfDNA 각각의 절대 정량값 (cp/mL)을 확인한다. NGS는 추가 정보를 얻을수 있는 수천 개의 표적을 동시에 시퀀싱할 수 있는 장점이 있으나, 상대적으로 처리 시간이 길고, 민감도가 가변적이며 고비용 검사이다. 연구자에 따라 15만-60만개의 SNP를 분석하기도 하나, 임상적 유용성 연구가 비교적 많이 보고되어 있는 Allosure/AlloSeq 키트 (CareDX)는 202개의 SNP 를 분석하고 전용 소프트웨어를 이용하여 dd-cfDNA% 결과를 도출한다. dd-PCR과 qPCR은 더 빠르고 저렴한 검출이 가능하나, 표적 SNP 수가 검사성능에 영향을 미칠 수 있으며, 대규모 임상적 유용성 연구가 없는 실정이다.

신이식 후 처음 2주까지 dd-cfDNA%는 급격히 감소하 며, 2주 이후에 T세포 매개 거부반응(T cell-mediated rejection, TCMR) 또는 항체 매개 거부반응(Antibody-mediated rejection, ABMR) 환자에서 cut-off (0.7-1.0%)이상의 dd-cfDNA%의 상승이 관찰된다. 신이식 환자에서 dd-cfDNA 검사의 임상적 유용성 평가결과는 연구자에 따라 차이가 있으나, 0.43-1.0% cut-off 를 이용할 때 민감도 59-89%, 특이도 69-85%, 양성 예측값 Positive Predictive Value, PPV) 12-77%, 음성 예측 값(Negative Predictive Value, NPV) 75-98%로 보고 되어 있다 [6].

dd-cfDNA 증가는 eGFR에 비해 거부반응 검출이 우수하 나, 거부반응 이외의 이식편 손상 (Graft injury)에서도 상승된다. DSA 음성, 면역억제제 부족에 의한 면역활성화, BK 바이러스 활성화 등에 인한 무증상 이식편 손상을 조기검출하는데 도움이 된다. 따라서, 높은 에피토프 불일치, 면역력이 높은 환자, 약물 순응도가 낮은 신이식 환자, BK nephropathy 가 의심되는 환자에서 dd-cfDNA 모니터링이 도움이 될 수 있다.

국내 일부 검사실에서 도입되어 사용 중인 AlloSeq 검사에서 권장하는 검사요건과 방법은 다음과 같다.

일란성 쌍둥이 이식에서는 dd-cfDNA 수준을 검출할 수없거나 재이식 환자의 경우처럼 두 개 이상의 다른 게놈의 존재를 구분할 수 없는 등 아직 해결되지 않은 한계가 있다. 또한, dd-cfDNA%는 수혜자의 백혈구 감소증, 백혈구 증가증 및 염증성 질환으로 인한 총 cfDNA 수치의 변화에 영향을 받아 위양성 또는 위음성으로 보고될 수 있다.

신이식 환자에서 이식 후 dd-cfDNA 수치의 상승이 거부 반응과 이식편 손상을 예측한다는 보고가 많은 연구에서 발표되고 있다. 그러나, 진단을 위한 cut-off 수치가 낮고 연구자마다 차이가 있으므로, 지속적인 추가연구가 필요하다. 특히, dd-cfDNA% 측정과 절대값 dd-cfDNA (cp/mL) 측정에 대한 임상적 유용성 비교 연구가 필요하다. 또한, 세포매개성거부반응 진단과 면역억제제 모니터링, BK nephropathy 진단을 위한 dd-cfDNA 역할에 대한 추가 연구도 요구된다. 검사과정에서는 검체처리, 배송 등 검사 전오류가 없는지 확인해야 하며, 결과를 해석할 때는 다른 생물학적 변수 (화자의 염증, 감염 등)에 의한 영향을 고려하 여야 한다. 마지막으로, 다른 검사와 마찬가지로 검사방법과 해석의 표준화가 진행되어야 할 것이다.