진단검사 분야의 연구자들이 에러율을 낮추려고 노력을 경주하는 곳은 일반적으로 이 두 번째 프로세스인데, 염기서열분석의 기술적인 면에 집중하면 할 수록, 첫 번째 프로세스의 확률론적인 면을 간과하게 되는 경향이 있다. 그런데 만약 검체에 cfDNA 조각이 없다면 sequencing depth를 아무리 늘린다 한들 변이를 검출할 방도가 없지 않은가? 실제 임상검사실에서 이러한 문제점은 더 두드러지는데, 기술의 내재적인 특성 상 변이가 한 번 관찰되었다고(single observation) 실제 변이를 검출했다고 확신할 수 없기 때문이다.

그래서 저자들은 MRDetect(genome-wide mutational integration)라는 모델을 개발하였다. MRDetect란 변이의 load (검출 사이트 개수)와 sequencing depth, 두 변수의 함수[1]로써 종양분율을 예측하는 것이다. MRDetect는 원발종양의 정보에 기반하여 특정 종양의 변이를 검출하는 방식으로, 원발종양을 일종의 개요서(compendium)로 이용한다. 일종의 양동작전인 orthogonal noise model은 환자가 특이하게 가지고 있는 변이를 다른 혈장 검체의 WGS 결과에 적용해서 환자-특이적이지 않은 artifact(예: MSI)를 거르는 방식으로 진행한다. 이렇게 해서 모든 검출된 변이 중에서 환자의 종양이 특이적으로 가지고 있는 변이만 골라낸다. 본 모델의 검증을 위해 저자들은 다양한 종양에서 발견되는 SNV를 in-silico로 전부 혼합한 데이터를 제작하였는데 이 in-silico 데이터의 모든 변이를 환자의 원발종양에 있던 변이에 매칭시킨다. 통합하는 변이의 수가 늘수록, 오류발생의 가능성이 높아지기 때문에, 환자의 정상조직(종양분율=0)인 matched germline WGS(5-35X)를 보완데이터로 사용하여 노이즈가 어느 정도인지 평가한다. 이 과정을 다음 그림에서 간단히 나타내었다.

물론 이러한 조작만으로 모든 문제가 해결되는 것은 아니므로, 추가적으로 민감도를 개선하기 위해서는 검사 오류에 의한 noise를 줄여야 했다. 염기서열분석의 품질을 측정하는 여러 계측치를 하나의 기준으로 바꿔야하므로, 저자들은 support vector machine(SVM)을 개발하였다[1]. SVM은 종양분율이 매우 낮아 sequencing depth의 역보다 더 낮은 상황에서 적용하기 위해 디자인한 모델로 SMV의 거르기 전략으로 노이즈를 14.4배 감소시켜 염기서열분석상의 오류를 1/10,000 base까지 낮추고 검사의 특이도를 95%까지 높일 수 있었다. >10,000개의 SNV 검출 시 표준 세팅의 depth에서도 종양검출의 민감도가 10-5까지 개선되었다(20X depth에서 85%, 50X depth에서 99% 검출률).

악성흑색종의 in-silico 데이터[depth(10-120X), mutation load (2,000-63,000), 종양분율(10-6-10-3)의 다양한 성상을 가진 검체들의 혼합]로 시행한 평가에서, 변이하중(mutational load)가 높을 경우, 120X depth로 10-6까지의 종양분율을 검출해낼 수 있어 민감도는 더욱 높아졌다.

MRDetect 모델로 얻어진 높은 민감도가 실제로 임상에서 술 후 잔류종양을 검출할 수 있는 지를 대장직장암 환자에서 영상검사와 비교하였고 이 때는 robustness를 더욱 강화하기 위해서 WGS데이터를 다운샘플링 방식으로 부트스트랩했다. 그 결과 수술 후 짧은 기간 내에 MRD cfDNA detection으로 영상검사보다 이르게 재발을 예측할 수 있었고 민감도와 특이도는 다음과 같았다.

본 실험모델에서 특히 유의해야 할 점은 하나의 환자-특이적인 SNV 사이트 검출로 어떤 해석을 하여서는 안되며, 함수로 나타내어지는 전체적인 변이 세트의 구성과 변이 검출률을 종합적으로 해석해야 한다는 것이다.검사의 수행력 자체는 그대로이면서 분석인자에 변화를 주어 민감도를 높인다는 발상은 어찌 보면 환자의 임상, 영상, 검사 결과를 종합하여 진단 확률을 높인다는 지극히 전통적인 진단 개념과 맞닿아 있어서 흥미롭다. 또한 수동적으로 기술 발전을 기다리지 않더라도 SNV 패널 선정과 데이터 조작으로 진단력을 높일 수 있다는 점에서 많은 진단검사의들의 도전 정신을 자극할 수도 있겠다.본고에 언급된 함수를 포함한 실험방법의 구체적인 내용과 사용한 데이터, 기타 추가 정보는 https://doi.org/10.1038/ s41591-020-0915-3 에서 찾아볼 수 있다.