Nortable Research
Functional evaluation and clinical
classification of BRCA2 variants
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학회뉴스
한양대학교병원 진단검사의학과
진단유전검사로 확인할 수 있는 체세포 BRCA2 유전자의 loss-of function 변이는 다양한 암의 발병에 기여합니다. 그러나 검사 결과에서 Variant of uncertain significance (VUS)가 확인된 경우 임상적 활용에 한계가 있습니다. 이러한 변이를 가진 개개인의 임상적 관리를 용이하게 하기 위해서는 모든 BRCA2 유전자 변이의 기능적 특성 파악과 임상적인 분류가 필요합니다. 이 논문에서는 BRCA2 유전자 중 pathogenic missense 변이가 주로 발생하는 DNA 결합 도메인(DNA-binding domain, DBD)인 엑손15번부터 26번 사이에서 발생할 수 있는 모든 단일염기변이(single nucleotide variant, SNV)를 분석했습니다. 이를 위해 인간 일배체 HAP1 세포에 CRISPR-Cas9 기반 knock-in endogeneous targeting 유전체 편집기술을 사용했으며, nonsense와 silent 변이로 상대적 보정을 하고 ClinVar의 pathogenic과 benign 변이와 homology-directed repair (HDR) functional assay 결과를 토대로 검증하였습니다. 6960개 중 6959개의 변이의 pathogenicity를 VarCall Bayesian model을 기반으로 7개 카테고리로 나누어 배분하였으며, Loss-of function missense 변이를 만드는 단일염기변이는 유방암과 난소암의 위험 증가에 연관이 있었습니다. 해당 연구 결과를 적용하여 BRCA2 변이를 ACMG-AMP, ClinGen 가이드라인에 따라 분류한 결과, 91%가 pathogenic, likely pathogenic 혹은 benign, likely benign으로 분류되었습니다. 이러한 변이의 분류는 향후 BRCA2 유전자 변이를 가진 사람의 임상적 관리를 개선하는데 활용될 수 있을 것입니다.
그림 1
BRCA2 유전자의 DBD 영역의 모든 SNV에 대한 Saturation genomic editing (SGE)
multiplex assay of variant effect (MAVE) 실험 개요. A, SGE 실험의 대상은 BRCA2 DBD 영역의 각 엑손 및 인접한 인트론의 10bp이며, 엑손4와 엑손25는 두 개 영역으로 나누어 총 14개의 영역을 타겟으로 함. B. SGE 워크플로우의 개요. 각 타겟 영역에서 가능한 모든 SNV를 포함하는 SNV 라이브러리를 그에 상응하는 Cas9-sgRNA construct와 함께 HAP1 일배체 세포에 주입 후 5일째(D5)와 14일째(D14) gDNA를 추출하여 타겟 영역을 증폭하고 타겟 gDNA 시퀀싱을 위해 바코딩을 함. 모든 SNV의 functional score 계산을 위해 SNV 양을 확인하고 표준화함. 해당 MAVE 기능검사 및 다른 근거를 기반으로 ACMG-AMP 가이드라인에 의거하여 기존에 분류된 변이를 재분류함.
Functional analysis of variant effects
각 시점(D0, D5, D14)의 변이 빈도는 전체 리드 수 대비 변이 리드 수의 비율로 계산하였으며, log2-transformed fold change (LFC) 값을 raw functional score로 사용하고, VarCall 모델에 의해 조정된 값을 얻었습니다. 또한 ACMG-AMP 가이드라인의 ClinGen-specified Bayesian interpretation를 바탕으로 하여 PS3/BS3 근거 수준을 7가지로 나누었습니다: pathogenic strong (Pstrong), Pmoderate, Psupporting; benign strong (Bstrong), Bmoderate, Bsupporting; VUS. VarCall 모델은 ClinVar에 등록된206개의 pathogenic 변이와 335개의 benign 변이로 검증하였으며, 해당 변이들은 최소한 BRCA1/2 VCEP나 최소 2개 이상의 ClinGen-인증 검사실에서 등록한 변이들로 선정하였습니다. 해당 분석은 nonsense와 silent 변이를 포함하여99% 이상의 민감도와 특이도를 보였으며, ClinVar의 missense 변이만 대상으로 한 경우 94%의 민감도와 95%의 특이도를 보였습니다. 또한 417개의 missense 변이를 HDR functional assay로 검증한 결과와 비교하면 93%의 민감도와 95%의 특이도를 보였습니다. HDR 실험에 이상소견이 있는 missense 변이 112개 중 7개(5.8%)가 BRCA2 MAVE에서 benign 으로 분류되었고, HDR에서 기능적으로 정상인 missense 변이 295개 중 14개(4.8%)가 MAVE에서 pathogenic으로 분류되었습니다.
그림 2
BRCA2 SNV의 functional annotation. A. 6959개 SNV의 raw functional score 분포. B
VarCall 모델에 의해 조정된 functional score 분포. C. 각 엑손에서 변이 유형 별 functional score 분포. D. 변이 유형 별 7가지 카테고리 분포. E. 14개 타겟 영역별 변이 유형별 카테고리 분포.
Comparisons with functional
BRCA2 MAVE 결과는 세포 기반 HDR assay와 높은 유사성을 보였으며(P=1.6 x 10-52), class4-5 (기능적으로 비정상)과 class3 (불명확)를 효과적으로 구분하고(P=4.8 x 10-7), olaparib PART inhibitor response assay에서 도출된 class1-2 (기능적으로 정상) 변이 또한 구분할 수 있었습니다(P=2.0 x 10-11). 또한 MAVE 결과는 엑손15와 17의 targeted prime-editing study 대상 변이 중 non-functional과 functional (P=3.4 x 10-8) 및 uncertain (P=1.3 x 10-6) 변이를 잘 구분하였으며, small embryonic stem cell complementation assay의 non-functional과 functional 변이(P=1.1 x 10-4) 역시 효과적으로 구분할 수 있었습니다. 다음으로 MAVE 결과를 in silico 예측값과 비교하였을 때 Align-GVGD 모델의 class65 (likely non-functional) 카테고리의 경우 어느 정도의 민감도(41%)와 높은 특이도(91%)를 보였으며, AlphaMissense deep-learning model 역시 likely pathogenic score (>0.564)를 기준으로 했을 때 중간 정도의 민감도(74%)와 특이도(84%)를 보였습니다. 현재 ClinGen BRCA1/2 VCEP에서 BRCA1/2 변이 curation을 위해 사용중인 BayesDel 예측모델과 비교하면 중간 정도의 민감도(73%)와 특이도(83%)를 보였습니다. 70개의 ClinVar 분류 missense 변이를 대상으로 하면 BRCA2 MAVE, AlphaMissense, BayesDel 모두 AUC 값이 0.96 이상이나, HDR로 확인된 변이를 대상으로 하면 BRCA2 MAVE 값(0.98)이 AlphaMissense (0.93)이나 BayesDel (0.86)보다 나은 소견을 보였습니다.
그림 3
BRCA2 MAVE 결과와 functional assay 및 in silico 예측값의 비교. A-D. HDR assay와의 비교, E. ClinVar 변이에 대한 MAVE와 두 in silico 예측값의 AUC 비교, F. HDR assay로 확인된 변이에 대한 MAVE와 두 in silico 예측값이 AUC 비교.
Clinical classification of SNVs
ClilnGen BRCA1/2 VCEP 분류체계는 점수체계를 사용하고 있는데, 이를 MAVE SNV에 적용해보았습니다. ACMG-AMP 가이드라인의 PS3/BS3 근거에서 Pstrong과 Bstrong은 최대 +4 혹은 -4점을 부여했고, Pmoderate와 Bmoderate는 +2 혹은 -2점, Psupporting과 Bsupporting은 +1 혹은 -1점을 부여했습니다. 각 변이는 10점 이상인 경우 pathogenic (P), 6 ~ 9점은 likely pathogenic (LP), -1 ~ 5점은 VUS, -6 ~ -2점은 likely benign (LB), -7점 이하는 benign (B)으로 분류하였습니다. 전체 SNV 중 5566개가 B/LB로 분류되었고, 785개는 P/LP, 608개는 VUS로 분류되었습니다. Nonsense 변이 중 3개는 LP로, 339개는 P로 분류되었으며, 4583개의 missense 변이 중 261개는 P/LP, 3786개는 B/LB, 나머지 536개가 VUS로 분류되었습니다. P/LP로 분류된 missense 변이들은 높은 유방암 위험도와 관련이 있었고(OR = 6.96, 95% CI = 4.77-10.56), B/LB로 분류된 missense 변이들은 유방암 위험 증가와 연관되어 있지 않았습니다((OR = 0.77, 95% CI = 0.70–0.83). 138개의 canonical splice site 변이 중 23개는 LP로 105는 P로 분류되었습니다.
그림 4
BRCA2 SNV의 임상적 분류.
[References]
1. Functional evaluation and clinical classification of BRCA2 variants. Nature. 2025;638(8050):528-537.
